2 × طق PCR ميكس

نموذج A-1

■ يحتوي القالب على شوائب بروتينية أو مثبطات Taq ، وما إلى ذلك - - تنقية قالب الحمض النووي ، وإزالة شوائب البروتين أو استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات التنقية.

■ لم يكتمل تمسخ القالب - - قم بزيادة درجة حرارة التمسخ بشكل مناسب وإطالة وقت التمسخ.

■ تدهور القالب - إعادة تجهيز القالب.

A-2 التمهيدي

■ نوعية رديئة من البرايمر - أعد تركيب البرايمر.

■ تحلل التمهيدي ——Aliquot الاشعال عالية التركيز إلى حجم صغير للحفظ. تجنب التجميد والذوبان المتكرر أو الاحتفاظ بالتبريد لمدة 4 درجات مئوية على المدى الطويل.

■ تصميم غير مناسب للبادئات (على سبيل المثال ، طول التمهيدي غير كافٍ ، يتكون ثنائي الطبقة بين البادئات ، وما إلى ذلك) - إعادة تصميم الاشعال (تجنب تشكيل ثنائي التمهيدي والبنية الثانوية)

أ -3 ملغ²⁺تركيز

■ ميغاغرام²⁺ تركيز منخفض للغاية - زيادة Mg بشكل صحيح²⁺ التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-4 درجة حرارة التلدين

■ درجة حرارة التلدين المرتفعة تؤثر على ارتباط البرايمر والقالب. —— تقليل درجة حرارة التلدين وتحسين الحالة بتدرج 2 درجة مئوية.

A-5 تمديد الوقت

■ وقت تمديد قصير - - زيادة وقت التمديد.

الظواهر: تظهر العينات السلبية أيضًا نطاقات التسلسل المستهدفة.

A-1 تلوث PCR

■ التلوث المتبادل للتسلسل المستهدف أو منتجات التضخيم —— بحذر لا تقم بمص العينة التي تحتوي على تسلسل الهدف في العينة السلبية أو انسكابها خارج أنبوب جهاز الطرد المركزي. يجب تعقيم الكواشف أو المعدات للتخلص من الأحماض النووية الموجودة ، ويجب تحديد وجود التلوث من خلال تجارب التحكم السلبية.

■ كاشف التلوث - قصف الكواشف وتخزينها في درجة حرارة منخفضة.

A-2 رئيس الوزراءr

■ ميغاغرام²⁺ تركيز منخفض للغاية - زيادة Mg بشكل صحيح²⁺ التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

■ تصميم تمهيدي غير لائق ، والتسلسل المستهدف له تجانس مع التسلسل غير المستهدف. —— إعادة تصميم الاشعال.

الظواهر: نطاقات تضخيم PCR غير متوافقة مع الحجم المتوقع ، سواء كان كبيرًا أو صغيرًا ، أو في بعض الأحيان تحدث كل من نطاقات التضخيم المحددة ونطاقات التضخيم غير المحددة.

أ -1 برايمر

■ ضعف خصوصية البرايمر

—— إعادة التصميم التمهيدي.

■ تركيز التمهيدي مرتفع جدًا - - قم بزيادة درجة حرارة التمسخ بشكل صحيح وإطالة وقت التمسخ.

A-2 ملغ²⁺ تركيز

■ The Mg²⁺ التركيز مرتفع جدًا - قلل تركيز Mg2 + بشكل صحيح: قم بتحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-3 البوليميراز الحراري

■ كمية الإنزيم الزائدة - تقليل كمية الإنزيم بشكل مناسب على فترات 0.5 وحدة.

A-4 درجة حرارة التلدين

■ درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا - - قم بزيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب أو اعتماد طريقة التلدين ذات المرحلتين

دورات A-5 PCR

■ دورات PCR كثيرة جدًا —— قم بتقليل عدد دورات PCR.

أ -1 برايمر- خصوصية رديئة - إعادة تصميم التمهيدي ، وتغيير موضع وطول التمهيدي لتعزيز خصوصيته ؛ أو تنفيذ PCR متداخلة.

A-2 قالب DNA

—القالب ليس خالصًا —— قم بتنقية القالب أو استخرج الحمض النووي باستخدام مجموعات التنقية.

أ -3 ملغ²⁺ تركيز

—— إم جي²⁺ التركيز مرتفع للغاية - قلل Mg بشكل صحيح²⁺ التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-4 dNTP

—— تركيز dNTPs مرتفع للغاية —— تقليل تركيز dNTP بشكل مناسب

أ -5 درجة حرارة التلدين

—— درجة حرارة تلدين منخفضة للغاية —— زيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب

دورات A-6

—— دورات كثيرة جدًا —— قم بتحسين رقم الدورة

الخطوة الأولى هي اختيار البوليميراز المناسب. لا يمكن تصحيح بوليميراز Taq العادي بسبب نقص نشاط نوكلياز خارجي 3'-5 '، وسيؤدي عدم التطابق إلى تقليل كفاءة التمديد للأجزاء بشكل كبير. لذلك ، لا يستطيع بوليميراز Taq العادي تضخيم الأجزاء المستهدفة التي يزيد حجمها عن 5 كيلو بايت بشكل فعال. يجب اختيار بوليميراز Taq مع تعديل خاص أو بوليميراز آخر عالي الدقة لتحسين كفاءة التمديد وتلبية احتياجات تضخيم الشظايا الطويلة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تضخيم الشظايا الطويلة أيضًا تعديلًا مطابقًا لتصميم التمهيدي ، ووقت التمسخ ، ووقت التمديد ، ودرجة الحموضة العازلة ، وما إلى ذلك. عادةً ، يمكن أن تؤدي البادئات ذات 18-24 زوج قاعدي إلى إنتاجية أفضل. من أجل منع تلف القالب ، يجب تقليل وقت التمسخ عند 94 درجة مئوية إلى 30 ثانية أو أقل لكل دورة ، ويجب أن يكون وقت رفع درجة الحرارة إلى 94 درجة مئوية قبل التضخيم أقل من دقيقة واحدة. علاوة على ذلك ، فإن ضبط درجة حرارة التمديد عند حوالي 68 درجة مئوية وتصميم وقت التمديد وفقًا لمعدل 1 كيلو بايت / دقيقة يمكن أن يضمن تضخيمًا فعالًا للشظايا الطويلة.

يمكن تقليل معدل الخطأ لتضخيم PCR باستخدام بوليميرات DNA مختلفة بدقة عالية. من بين جميع بوليمرات Taq DNA الموجودة حتى الآن ، فإن إنزيم Pfu لديه أقل معدل خطأ وأعلى دقة (انظر الجدول المرفق). بالإضافة إلى اختيار الإنزيم ، يمكن للباحثين تقليل معدل طفرة تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تحسين ظروف التفاعل ، بما في ذلك تحسين تكوين المخزن المؤقت وتركيز البوليميراز الحراري وتحسين رقم دورة PCR.