2 × Pfu PCR Mix

فائق النقاء وعالي الدقة بوليميريز DNA Taq.

يتم التعبير عن Pfu DNA Polymerase من E.coli مع جين Pyrococus Furiosis DNA Polymerase المستنسخ وتنقيته وفصله عن طريق تنقية متعددة الأعمدة. نظرًا لأن Pfu يحتوي على نشاط نوكلياز خارجي 3′-5 ، فإنه يمكن تدقيقه في عملية تضخيم الحمض النووي ، بينما لا يمكن لبوليميراز DNA Taq التقليدي. على الرغم من أن بوليميرات Taq DNA الأخرى مثل Vent و Deep Vent و Tli و UITma وما إلى ذلك لها وظائف تدقيق ، فإن Pfu لديها أقل معدل عدم تطابق بين جميع بوليمرات Taq DNA الموجودة حتى الآن. يتمتع Pfu DNA Polymerase باستقرار حراري أفضل من بوليميريز DNA Taq الشائع ، ويمكنه الحفاظ على أكثر من 90 ٪ من النشاط عند 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

أنبوب واحد Pfu PCR Mix (شهادة المنتج الوطنية عالية التقنية)

■ قام Pfu PCR Mix بتحسين نوعية وحساسية تفاعل PCR ويمكنه تضخيم القوالب المعقدة ذات المحتوى العالي من GC ، والبنية الثانوية وما شابه ذلك. يمكن تضخيم نسختين من القالب المستهدف ، مما يضمن نتائج تجريبية أكثر دقة.

■ تجعل صيغة Pfu MasterMix الفريدة نظام التفاعل بأكمله مستقرًا للغاية ، ولن يتأثر النشاط بالتجميد المتكرر للذوبان أو التخزين طويل الأجل عند 4 درجات مئوية.

■ يمكن لحل مزيج PCR المستقر والفعال المعد مسبقًا أن يجعل العملية سريعة وبسيطة ، مما يقلل بشكل كبير من كثافة العمالة وخطأ أخذ العينات. يتم أيضًا تضمين مُحسِّن ومُحسِّن PCR عالي الأداء في المزيج ، مما يقلل من متطلبات ظروف PCR.

■ يحتوي هذا المنتج على أنظمة تحتوي على صبغة وخالية من الصبغة. يمكن فصل منتجات PCR Mix المحتوية على صبغ كهربائيًا مباشرةً بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، دون إضافة محلول عينة.

قط. لا	حجم التعبئة
4992780	1 مل
4992781	5 * 1 مل
4992782	1 مل
4992906	5 * 1 مل

أرسل بريدًا إلكترونيًا إلينا

تفاصيل المنتج

سير العمل

التعليمات

علامات المنتج

تعريف النشاط

يتم تعريف نشاط وحدة واحدة (U) Pfu DNA Polymerase على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لدمج 10 نانومول ديوكسينوكليوتيدات في مواد غير قابلة للذوبان في الحمض عند 74 درجة مئوية في غضون 30 دقيقة باستخدام DNA السلمون المنشط للحيوانات المنوية كقالب / تمهيدي.

مراقبة الجودة

النقاء بواسطة كشف SDS-PAGE أكثر من 99٪ ؛ لم يتم الكشف عن أي نشاط للنوكلياز الخارجي ؛ يمكن تضخيم جين نسخة واحدة في الجينوم البشري بشكل فعال ؛ لا يوجد تغيير ملحوظ في النشاط عند التخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع.

المؤشرات الفنية الاساسية

لديها نشاط نوكلياز خارجي 3′-5 ولا يوجد نشاط نوكلياز خارجي 5′-3. سرعة التمديد لتضخيم الحمض النووي أقل من سرعة بوليميريز Taq ، وعمومًا فإن سرعة تمديد إنزيم Pfu هي 0.5-1 كيلو بايت في الدقيقة. الاستقرار الحراري لـ Pfu أفضل من Taq. بالنسبة للقوالب ذات المحتوى العالي من GC ، يمكن زيادة درجة حرارة التمسخ إلى 98 درجة مئوية ، مما لا يؤثر على نشاط بوليميريز Pfu. منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذو نهايات حادة ، ويمكن إضافته مع 3'-dA المتدلية قبل ربطه بموجه TA أو استنساخه باستخدام ناقل غير حاد الأطراف

التطبيقات

يمكن استخدامه لتضخيم عالي الدقة للحمض النووي ، مثل استنساخ التعبير الجيني ، والطفرة الموجهة بالموقع ، وتحليل تعدد الأشكال للنيوكليوتيدات المفردة (SNP) وإصلاح النهاية.

يمكن تخصيص جميع المنتجات لـ ODM / OEM. للتفاصيل،الرجاء النقر فوق خدمة مخصصة (ODM / OEM)

سابق: مجموعة الطفرات السريعة الموجهة بالموقع

التالي: مجموعة Ultra HiFidelity PCR

استخدم الحمض النووي الجيني كقالب لتضخيم جزء 1 كيلوبايت.
بعد تفاعل PCR ، خذ 5 ميكرولتر للكشف عن الرحلان الكهربي.

س: لا نطاقات تضخيم

نموذج A-1

■ يحتوي القالب على شوائب بروتينية أو مثبطات Taq ، وما إلى ذلك - - تنقية قالب الحمض النووي ، وإزالة شوائب البروتين أو استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات التنقية.

■ لم يكتمل تمسخ القالب - - قم بزيادة درجة حرارة التمسخ بشكل مناسب وإطالة وقت التمسخ.

■ تدهور القالب - إعادة تجهيز القالب.

A-2 التمهيدي

■ نوعية رديئة من البرايمر - أعد تركيب البرايمر.

■ تحلل التمهيدي ——Aliquot الاشعال عالية التركيز إلى حجم صغير للحفظ. تجنب التجميد والذوبان المتكرر أو الاحتفاظ بالتبريد لمدة 4 درجات مئوية على المدى الطويل.

■ تصميم غير مناسب للبادئات (على سبيل المثال ، طول التمهيدي غير كافٍ ، يتكون ثنائي الطبقة بين البادئات ، وما إلى ذلك) - إعادة تصميم الاشعال (تجنب تشكيل ثنائي التمهيدي والبنية الثانوية)

أ -3 ملغ²⁺تركيز

■ ميغاغرام²⁺ تركيز منخفض للغاية - زيادة Mg بشكل صحيح²⁺التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-4 درجة حرارة التلدين

■ درجة حرارة التلدين المرتفعة تؤثر على ارتباط البرايمر والقالب. —— تقليل درجة حرارة التلدين وتحسين الحالة بتدرج 2 درجة مئوية.

A-5 تمديد الوقت

■ وقت تمديد قصير - - زيادة وقت التمديد.

س: خطأ إيجابي

الظواهر: تظهر العينات السلبية أيضًا نطاقات التسلسل المستهدفة.

A-1 تلوث PCR

■ التلوث المتبادل للتسلسل المستهدف أو منتجات التضخيم —— بحذر لا تقم بمص العينة التي تحتوي على تسلسل الهدف في العينة السلبية أو انسكابها خارج أنبوب جهاز الطرد المركزي. يجب تعقيم الكواشف أو المعدات للتخلص من الأحماض النووية الموجودة ، ويجب تحديد وجود التلوث من خلال تجارب التحكم السلبية.

■ كاشف التلوث - قصف الكواشف وتخزينها في درجة حرارة منخفضة.

A-2 رئيس الوزراءr

■ ميغاغرام²⁺ تركيز منخفض للغاية - زيادة Mg بشكل صحيح²⁺ التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

■ تصميم تمهيدي غير لائق ، والتسلسل المستهدف له تجانس مع التسلسل غير المستهدف. —— إعادة تصميم الاشعال.

س: التضخيم غير المحدد

الظواهر: نطاقات تضخيم PCR غير متوافقة مع الحجم المتوقع ، سواء كان كبيرًا أو صغيرًا ، أو في بعض الأحيان تحدث كل من نطاقات التضخيم المحددة ونطاقات التضخيم غير المحددة.

أ -1 برايمر

■ ضعف خصوصية البرايمر

—— إعادة التصميم التمهيدي.

■ تركيز التمهيدي مرتفع جدًا - - قم بزيادة درجة حرارة التمسخ بشكل صحيح وإطالة وقت التمسخ.

A-2 ملغ²⁺ تركيز

■ The Mg²⁺ التركيز مرتفع جدًا - قلل تركيز Mg2 + بشكل صحيح: قم بتحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-3 البوليميراز الحراري

■ كمية الإنزيم الزائدة - تقليل كمية الإنزيم بشكل مناسب على فترات 0.5 وحدة.

A-4 درجة حرارة التلدين

■ درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا - - قم بزيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب أو اعتماد طريقة التلدين ذات المرحلتين

دورات A-5 PCR

■ دورات PCR كثيرة جدًا —— قم بتقليل عدد دورات PCR.

س: عصابات غير مكتملة أو مسحة

أ -1 برايمر- خصوصية رديئة - إعادة تصميم التمهيدي ، وتغيير موضع وطول التمهيدي لتعزيز خصوصيته ؛ أو تنفيذ PCR متداخلة.

A-2 قالب DNA

—القالب ليس خالصًا —— قم بتنقية القالب أو استخرج الحمض النووي باستخدام مجموعات التنقية.

أ -3 ملغ²⁺ تركيز

—— إم جي²⁺ التركيز مرتفع للغاية - قلل Mg بشكل صحيح²⁺ التركيز: تحسين Mg²⁺ التركيز بسلسلة من التفاعلات من 1 مم إلى 3 مم بفاصل 0.5 ملي مولار لتحديد أفضل ملغ²⁺ التركيز لكل قالب وتمهيدي.

A-4 dNTP

—— تركيز dNTPs مرتفع للغاية —— تقليل تركيز dNTP بشكل مناسب

أ -5 درجة حرارة التلدين

—— درجة حرارة تلدين منخفضة للغاية —— زيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب

دورات A-6

—— دورات كثيرة جدًا —— قم بتحسين رقم الدورة

س: ما مقدار قالب الحمض النووي الذي يجب إضافته في نظام تفاعل 50 ميكرولتر PCR؟

س: كيف تضخيم شظايا طويلة؟

الخطوة الأولى هي اختيار البوليميراز المناسب. لا يمكن تصحيح بوليميراز Taq العادي بسبب نقص نشاط نوكلياز خارجي 3'-5 '، وسيؤدي عدم التطابق إلى تقليل كفاءة التمديد للأجزاء بشكل كبير. لذلك ، لا يستطيع بوليميراز Taq العادي تضخيم الأجزاء المستهدفة التي يزيد حجمها عن 5 كيلو بايت بشكل فعال. يجب اختيار بوليميراز Taq مع تعديل خاص أو بوليميراز آخر عالي الدقة لتحسين كفاءة التمديد وتلبية احتياجات تضخيم الشظايا الطويلة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تضخيم الشظايا الطويلة أيضًا تعديلًا مطابقًا لتصميم التمهيدي ، ووقت التمسخ ، ووقت التمديد ، ودرجة الحموضة العازلة ، وما إلى ذلك. عادةً ، يمكن أن تؤدي البادئات ذات 18-24 زوج قاعدي إلى إنتاجية أفضل. من أجل منع تلف القالب ، يجب تقليل وقت التمسخ عند 94 درجة مئوية إلى 30 ثانية أو أقل لكل دورة ، ويجب أن يكون وقت رفع درجة الحرارة إلى 94 درجة مئوية قبل التضخيم أقل من دقيقة واحدة. علاوة على ذلك ، فإن ضبط درجة حرارة التمديد عند حوالي 68 درجة مئوية وتصميم وقت التمديد وفقًا لمعدل 1 كيلو بايت / دقيقة يمكن أن يضمن تضخيمًا فعالًا للشظايا الطويلة.

س: كيفية تحسين دقة التضخيم لـ PCR؟

يمكن تقليل معدل الخطأ لتضخيم PCR باستخدام بوليميرات DNA مختلفة بدقة عالية. من بين جميع بوليمرات Taq DNA الموجودة حتى الآن ، فإن إنزيم Pfu لديه أقل معدل خطأ وأعلى دقة (انظر الجدول المرفق). بالإضافة إلى اختيار الإنزيم ، يمكن للباحثين تقليل معدل طفرة تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تحسين ظروف التفاعل ، بما في ذلك تحسين تكوين المخزن المؤقت وتركيز البوليميراز الحراري وتحسين رقم دورة PCR.

اكتب رسالتك هنا وأرسلها إلينا